Protein adalah salah satu bio-makromolekul yang
penting perananya dalam makhluk hidup. Fungsi dari protein itu sendiri secara garis
besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural
dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular. Apabila tulang dan kitin
adalah beton, maka protein struktural adalah dinding batu-batanya. Beberapa
protein struktural, fibrous
protein, berfungsi sebagai pelindung,
sebagai contoh α dan β- keratin yang
terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan protein struktural lain ada
juga yang berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein dapat memerankan
fungsi sebagai bahan structural karena seperti halnya polimer lain, protein
memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan lain-lain. Selain itu protein juga dapat
berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk
hidup. Makromolekul ini mengendalikan jalur dan waktu metabolisme yang kompleks
untuk menjaga kelangsungan hidup suatu
organisma. Suatu sistem metabolisme akan
terganggu apabila biokatalis yang berperan di dalamnya mengalami kerusakan
(Hertadi, 2008. rhertadi@biotitech.ac.jp)
A. Protein
1.1. Definisi dan Ciri-ciri
Istilah protein diperkenalkan pada tahun 1830-an
oleh pakar
kimia Belanda bernama Mulder, yang merupakan
salah satu dari orang-orang pertama yang mempelajari kimia dalam protein secara
sistematik. Ia secara tepat menyimpulkan peranan inti dari protein dalam sistem
hidup dengan menurunkan nama dari bahasa Yunani proteios,
yang berarti “bertingkat pertama”. Protein merupakan makromolekul yang menyusun
lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan ukuran dan struktur sel,
komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis berbagai
reaksi biokimia di dalam sel. Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian
biokimia tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi dan enzim.
Semua jenis protein terdiri dari rangkaian dan
kombinasi dari 20
asam amino. Setiap jenis protein mempunyai jumlah
dan urutan asam
amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat
baik pada membran
plasma maupun membran internal yang menyusun
organel sel seperti
mitokondria, retikulum endoplasma, nukleus dan
badan golgi dengan
fungsi yang berbeda-beda tergantung pada
tempatnya. Protein-protein
yang terlibat dalam reaksi biokimia sebagian
besar berupa enzim
banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian
terdapat pada
kompartemen dari organel sel. Protein merupakan
kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar
makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak
stabil.
Protein merupakan komponen utama bagi semua benda
hidup
termasuk mikroorganisme, hewan dan tumbuhan.
Protein merupakan
rantaian gabungan 22 jenis asam amino. Protein
ini memainkan
berbagai peranan dalam benda hidup dan
bertanggungjawab untuk
fungsi dan ciri-ciri benda hidup (Anonim. 2008.
Protein.
(http://www.wikipedia.com) diakses tanggal 12
Oktober 2008).
Keistimewaan lain dari protein ini adalah
strukturnya yang
mengandung N (15,30-18%), C (52,40%), H
(6,90-7,30%), O (21-
23,50%), S (0,8-2%), disamping C, H, O (seperti
juga karbohidrat dan
lemak), dan S kadang-kadang P, Fe dan Cu (sebagai
senyawa
kompleks dengan protein). Dengan demikian maka
salah satu cara
terpenting yang cukup spesifik untuk menentukan
jumlah protein
secara kuantitatif adalah dengan penentuan
kandungan N yang ada
dalam bahan makanan atau bahan lain (Sudarmaji,
S, dkk. 1989.
Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta).
Ciri-ciri Protein
Protein diperkenalkan sebagai molekul makro
pemberi
keterangan, karena urutan asam amino dari protein
tertentu
mencerminkan keterangan genetik yang terkandung
dalam urutan
basa dari bagian yang bersangkutan dalam DNA yang
mengarahkan
biosintesis protein. Tiap jenis protein ditandai
ciri-cirinya oleh:
1. Susunan kimia yang khas
Setiap protein individual merupakan senyawa murni
2. Bobot molekular yang khas
Semua molekul dalam suatu contoh tertentu dari
protein murni
mempunyai bobot molekular yang sama. Karena
molekulnya yang
besar maka protein mudah sekali mengalami
perubahan fisik
ataupun aktivitas biologisnya.
3. Urutan asam amino yang khas
Urutan asam amino dari protein tertentu adalah
terinci secara
genetik. Akan tetapi, perubahan-perubahan kecil
dalam urutan
asam amino dari protein tertentu (Page, D.S.
1997)
1.2. Fungsi dan Peranan Protein
Protein memegang peranan penting dalam berbagai
proses
biologi. Peran-peran tersebut antara lain:
1. Katalisis enzimatik
Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi
dikatalisis oleh
enzim dan hampir semua enzim adalah protein.
2. Transportasi dan penyimpanan
Berbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport
oleh protein spesifik.
Misalnya transportasi oksigen di dalam eritrosit
oleh hemoglobin
dan transportasi oksigen di dalam otot oleh
mioglobin.
3. Koordinasi gerak
Kontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua
filamen protein.
Contoh lainnya adalah pergerakan kromosom saat
proses mitosis
dan pergerakan sperma oleh flagela.
4. Penunjang mekanis
Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh
kolagen yang
merupakan protein fibrosa.
5. Proteksi imun
Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik
dan dapat
mengenal serta berkombinasi dengan benda asing
seperti virus,
bakteri dan sel dari organisma lain.
6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf
Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik
diperantarai oleh oleh
protein reseptor. Misalnya rodopsin adalah
protein yang sensitif
terhadap cahaya ditemukan pada sel batang retina.
Contoh lainnya
adalah protein reseptor pada sinapsis.
7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi
Pada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan
diferensiasi diatur
oleh protein faktor pertumbuhan. Misalnya faktor
pertumbuhan
saraf mengendalikan pertumbuhan jaringan saraf.
Selain itu,
banyak hormon merupakan protein (Santoso, H.
2008)
1.3. Jenis-jenis Protein
a. Kolagen, protein struktur yang diperlukan
untuk membentuk
kulit, tulang dan ikatan tisu.
b Antibodi, protein sistem pertahanan yang
melindungi badan
daripada serangan penyakit.
c Dismutase superoxide, protein yang membersihkan
darah
kita.
d Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara
badan.
e Hemoglobin, protein yang berfungsi sebagai
pembawa
oksigen
f Toksin, protein racun yang digunakan untuk
membunuh
kuman.
g Insulin, protein hormon yang mengawal aras
glukosa dalam
darah.
h Tripsin, protein yang mencernakan makanan
protein.
1.4. Sumber Protein
Protein lengkap yang mengandung semua jenis asam
amino
esensial, ditemukan dalam daging, ikan, unggas,
keju, telur, susu,
produk sejenis Quark, tumbuhan berbiji, suku
polong-polongan, dan
kentang.
Protein tidak lengkap ditemukan dalam sayuran,
padi-padian,
dan polong-polongan.
Sloane, E. 2004. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Penerbit
Buku Kedokteran EGC: Jakarta.
Studi dari Biokimiawan USA Thomas Osborne Lafayete Mendel,
Profesor untuk biokimia di Yale, 1914,
mengujicobakan protein
konsumsi dari daging dan tumbuhan kepada kelinci.
Satu grup kelincikelinci
tersebut diberikan makanan protein hewani,
sedangkan grup
yang lain diberikan protein nabati. Dari
eksperimennya didapati bahwa
kelinci yang memperoleh protein hewani lebih
cepat bertambah
beratnya dari kelinci yang memperoleh protein
nabati. Kemudian studi
selanjutnya, oleh McCay dari
Universitas Berkeley menunjukkan
bahwa kelinci yang memperoleh protein nabati,
lebih sehat dan hidup
dua kali lebih lama (Anonim. 2008. Protein.
(http://www.wikipedia.com)
diakses tanggal 12 Oktober 2008).
Kualitas protein didasarkan pada kemampuannya
untuk
menyediakan nitrogen dan asam amino bagi
pertumbuhan, pertahanan
dan memperbaiki jaringan tubuh. Secara umum kualitas
protein
tergantung pada dua karakteristik berikut:
1. Digestibilitas protein (untuk dapat digunakan
oleh tubuh, asam
amino harus dilepaskan dari komponen lain makanan
dan dibuat
agar dapat diabsorpsi. Jika komponen yang tidak
dapat dicerna
mencegah proses ini asam amino yang penting
hilang bersama
feses).
2. Komposisi asam amino seluruh asam amino yang
digunakan dalam
sintesis protein tubuh harus tersedia pada saat
yang sama agar
jaringan yang baru dapat terbentuk.dengan
demikian makanan
harus menyediakan setiap asam amino dalam jumlah
yang
mencukupi untuk membentuk as.amino lain yang
dibutuhkan.
Faktor yang mempengaruhi kebutuhan protein:
a. Perkembang jaringan
Periode dimana perkembangn terjadi dengan cepat
seperti pada
masa janin dan kehamilan membutuhkan lebih banyak
protein.
b. Kualitas protein
Kebutuhan protein dipengaruhi oleh kualitas
protein makanan pola
as.aminonya. Tidak ada rekomendasi khusus untuk
orang-orang
yang mengonsumsi protein hewani bersama protein
nabati. Bagi
mereka yang tidak mengonsumsi protein hewani
dianjurkan untuk
memperbanyak konsumsi pangan nabatinya untuk
kebutuhan asam
amino.
c. Digestibilitas protein
Ketersediaan as.amino dipengaruhi oleh persiapan
makanan.
Panas menyebabkan ikatan kimia antara gula dan
as.amino yang
membentuk ikatan yang tidak dapat dicerna.
Digestibitas dan
absorpsi dipengaruhi oleh jarak antara waktu
makan, dengan
interval yang lebih panjang akan menurunkan
persaingan dari
enzim yang tersedia dan tempat absorpsi.
d. Kandungan energi dari makanan
Jumlah yang mencukupi dari karbohidrat harus
tersedia untuk
mencukupi kebutuhan energi sehingga protein dapat
digunakan
hanya untuk pembagunan jaringn. Karbohidrat juga
mendukung
sintesis protein dengan merangsang pelepasan
insulin.
e. Status kesehatan
Dapat meningkatkan kebutuhan energi karena
meningkatnya
katabolisme. Setelah trauma atau operasi asam
amino dibutuhkan
untuk pembentukan jaringan, penyembuhan luka dan
produksi
faktor imunitas untuk melawan infeksi (Anonim.
2007).
B. Penggolongan Protein
Protein adalah molekul yang sangat vital untuk
organisme dan
terdapat di semua sel. Protein merupakan polimer
yang disusun oleh 20
macam asam amino standar. Rantai asam amino
dihubungkan dengan
ikatan kovalen yang spesifik. Struktur &
fungsi ditentukan oleh kombinasi,
jumlah dan urutan asam amino sedangkan sifat
fisik dan kimiawi
dipengaruhi oleh asam amino penyusunnya.
Penggolongan protein dibedakan menjadi beberapa
macam, antara
lain:
1. Berdasarkan struktur molekulnya
Struktur protein terdiri dari empat macam :
1. Struktur primer (struktur utama)
Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang
dihubungkan satu
sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida.
2. Struktur sekunder
Protein sudah mengalami interaksi intermolekul,
melalui rantai
samping asam amino. Ikatan yang membentuk
struktur ini, didominasi
oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang
membentuk pola
tertentu bergantung pada orientasi ikatan
hidrogennya. Ada dua jenis
struktur sekunder, yaitu: -heliks dan -sheet.
3. Struktur Tersier
Terbentuk karena adanya pelipatan membentuk
struktur yang
kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan
hidrogen, ikatan disulfida,
interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan
hidrofilik.
4. Struktur Kuartener
Terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan
kata lain multi sub
unit. Interaksi intermolekul antar sub unit
protein ini membentuk
struktur keempat/kuartener
2. Berdasarkan Bentuk dan Sifat Fisik
1. Protein globular
Terdiri dari polipeptida yang bergabung satu sama
lain (berlipat
rapat) membentuk bulat padat. Misalnya enzim,
albumin, globulin,
protamin. Protein ini larut dalam air, asam,
basa, dan etanol.
2. Protein serabut (fibrous protein)
Terdiri dari peptida berantai panjang dan berupa
serat-serat yang
tersusun memanjang, dan memberikan peran
struktural atau
pelindung. Misalnya fibroin pada sutera dan
keratin pada rambut
dan bulu domba. Protein ini tidak larut dalam
air, asam, basa,
maupun etanol.
3. Berdasarkan Fungsi Biologi
Pembagian protein didasarkan pada fungsinya di
dalam tubuh, antara
lain:
1. Enzim (ribonukease, tripsin)
2. Protein transport (hemoglobin, mioglobin,
serum, albumin)
3. Protein nutrien dan penyimpan (gliadin/gandum,
ovalbumin/telur,
kasein/susu, feritin/jaringan hewan)
4. Protein kontraktil (aktin dan tubulin)
5. Protein Struktural (kolagen, keratin, fibrion)
6. Protein Pertahanan (antibodi, fibrinogen dan
trombin, bisa ular)
7. Protein Pengatur (hormon insulin dan hormon
paratiroid)
4. Berdasarkan Daya Larutnya
1. Albumin
Larut air, mengendap dengan garam konsentrasi
tinggi. Misalnya
albumin telur dan albumin serum
2. Globulin Glutelin
Tidak larut dalam larutan netral, larut asam dan
basa encer.
Glutenin (gandum), orizenin (padi).
3. Gliadin (prolamin)
Larut etanol 70-80%, tidak larut air dan etanol
100%.
Gliadin/gandum, zein/jagung
4. Histon
Bersifat basa, cenderung berikatan dengan asam
nukleat di dalam
sel. Globin bereaksi dengan heme (senyawa asam
menjadi
hemoglobin). Tidak larut air, garam encer dan
pekat (jenuh 30-
50%). Misalnya globulin serum dan globulin telur.
5. Protamin
Larut dalam air dan bersifat basa, dapat
berikatan dengan asam
nukleat menjadi nukleoprotamin (sperma ikan).
Contohnya salmin
5. Protein Majemuk
Adalah protein yang mengandung senyawa bukan
hanya protein
1. Fosfoprotein
Protein yang mengandung fosfor, misalnya kasein
pada susu,
vitelin pada kuning telur
2. Kromoprotein
Protein berpigmen, misalnya asam askorbat
oksidase mengandung
Cu
3. Fosfoprotein
Protein yang mengandung fosfor, misalnya kasein
pada susu,
vitelin pada kuning telur
4. Kromoprotein
Protein berpigmen, misalnya asam askorbat
oksidase mengandung
Cu
5. Protein Koenzim
Misalnya NAD+, FMN, FAD dan NADP+
6. Protein Koenzim
Misalnya NAD+, FMN, FAD dan NADP+
7. Lipoprotein
Mengandung asam lemak, lesitin
8. Metaloprotein
Mengandung unsur-unsur anorganik (Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Mg dsb)
9. Glikoprotein
Gugus prostetik karbohidrat, misalnya musin (pada
air liur),
oskomukoid (pada tulang)
10.Nukleoprotein
Protein dan asam nukleat berhubungan (berikatan
valensi
sekunder) misalnya pada jasad renik
C. Analisa Protein
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua
metode, yaitu ;
Secara kualitatif terdiri atas ; reaksi
Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole,
reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi
Sakaguchi.
Secara kuantitatif terdiri dari ; metode
Kjeldahl, metode titrasi formol,
metode Lowry, metode spektrofotometri visible
(Biuret), dan metode
spektrofotometri UV.
Analisa Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan
hati-hati ke dalam
larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan
putih yang dapat
berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi
yang terjadi ialah
nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada
molekul protein. Reaksi
ini positif untuk protein yang mengandung tirosin,
fenilalanin dan
triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat
direaksikan dengan
pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam
glioksilat. Pereaksi ini
dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium
dalam air. Setelah
dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam
sulfat dituangkan
perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di
bawah larutan protein.
Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu
pada batas antara
kedua lapisan tersebut.
3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan
merkuri nitrat dalam asam
nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada
larutan protein, akan
menghasilkan endapan putih yang dapat berubah
menjadi merah oleh
pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk
fenol-fenol, karena
terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus
hidroksifenil yang
berwarna.
4. Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan
menghasilkan warna
merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH
bebas. Jadi
protein yang mengandung sistein dapat memberikan
hasil positif.
5. Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan
natriumhipobromit. Pada
dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif
apabila ada gugus
guanidin. Jadi arginin atau protein yang
mengandung arginin dapat
menghasilkan warna merah.
6. Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH
kemudian ditambahkan
larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan
adanya senyawasenyawa
yang mengandung gugus amida asam yang berada
bersama
gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi
positif yaitu ditandai
dengan timbulnya warna merah violet atau biru
violet.
Analisa Kuantitatif
Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua
metode, yaitu: Metode
konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari
destruksi, destilasi, titrasi),
titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak
terlarut.
Metode modern, yaitu metode Lowry, metode
spektrofotometri visible,
metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk
protein terlarut.
1. Metode Kjeldahl
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk
penetapan
nitrogen total pada asam amino, protein, dan
senyawa yang
mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan
asam sulfat dan
dikatalisis dengan katalisator yang sesuai
sehingga akan
menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan
alkali dengan
kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara
kuantitatif ke dalam
larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
Penetapan Kadar
Prosedur :
a. Timbang 1 g bahan yang telah dihaluskan,
masukkan dalam labu
Kjeldahl (kalau kandungan protein tinggi, misal kedelai
gunakan
bahan kurang dari 1 g).
b. Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan
0,35 g raksa (II)
oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.
c. Panaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam
lemari asam
sampai berhenti berasap dan teruskan pemanasan
sampai
mendidih dan cairan sudah menjadi jernih.
Tambahkan pemanasan
kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan
biarkan sampai
dingin.
d. Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest dalam
labu Kjeldahl yang
didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn,
tambahkan 15
ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan
akhirnya tambahkan
perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50%
sebanyak 50 ml
yang telah didinginkan dalam lemari es.
e. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada
alat destilasi.
Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua
lapis cairan
tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai
mendidih.
f. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang
telah diisi dengan
larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan
indikator
merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak
5 tetes, ujung
pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam
larutan asam
klorida 0,1N.
g. Proses destilasi selesai jika destilat yang
ditampung lebih kurang
75 ml. Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak
bereaksi dengan
destilat dititrasi dengan larutan baku natrium
hidroksida 0,1N. Titik
akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan
warna larutan dari merah
menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.
Kadar Protein
Kadar protein dihitung dengan persamaan berikut :
Kadar = V NaOH blanko – V NaOH sampel x N NaOH x
14,008 x 100% x Fk
berat sampel (mg)
Keterangan :
Fk : faktor koreksi
Fk N : 16
2. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH)
lalu ditambahkan
formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya
dimethilol
ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan
tidak akan mempengaruhi
reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga
akhir titrasi dapat
diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan
adalah p.p., akhir
titrasi bila tepat terjadi perubahan warna
menjadi merah muda yang
tidak hilang dalam 30 detik.
3. Metode Lowry
Prosedur :
Pembuatan reagen Lowry A :
Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam
fosfomolibdat dengan
perbandingan (1 : 1)
Pembuatan reagen Lowry B :
Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml
natrium hidroksida
0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml
tembaga (II) sulfat
1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%.
Penetapan Kadar
a. Pembuatan kurva baku
Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi
300
μg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung
reaksi, misal dengan
komposisi berikut :
Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml
reagen Lowry B
dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1
ml reagen Lowry
A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca
absorbansinya pada
panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai
blanko adalah
tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)
b. Penyiapan Sampel
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang
terlarut misal albumin,
endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat
kristal
(jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya,
kalau perlu sampai
mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam
larutan). Pisahkan protein
yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama
10 menit,
pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan
proteinnya
kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam
asetat pH 5 misal
sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan
penetapan
selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari
penambahan 8 ml
reagen Lowry A sampai seterusnya.
4. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)
Prosedur :
Pembuatan reagen Biuret :
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O)
dan kalium
natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml
aquades dalam labu
takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium
hidroksida 10%
sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan
aquades sampai garis
tanda.
Pembuatan larutan induk bovin serum
albumin (BSA):
Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan
dalam aquades
sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0%
(Li).
Penetapan kadar (Metode Biuret) :
Pembuatan kurva baku :
Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen
Biuret dan aquades
misal dengan komposisi sebagai berikut:
Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada λ 550
nm terhadap
blanko yang terdiri dari 800 μL reagen Biuret dan
200 μL aquades.
Cara mempersiapkan sampel :
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang
terlarut misal albumin,
endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat
kristal
(jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya,
kalau perlu sampai
mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam
larutan). Pisahkan protein
yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama
10 menit,
pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan
proteinnya
kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam
asetat pH 5 misal
sampai 10,0 ml. Ambil sejumlah μL larutan
tersebut secara kuantitatif
kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu
tambah dengan
dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret,
baca
absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap
blanko yang
berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5.
Perhatikan adanya faktor
pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin
harus masuk
dalam kisaran absorban kurva baku.
5. Metode Spektrofotometri UV
Asam amino penyusun protein diantaranya adalah
triptofan, tirosin dan
fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik.
Triptofan mempunyai
absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk
tirosin mempunyai
absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin
menyerap sinar kurang
kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek.
Absorpsi sinar pada
280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi
protein dalam
larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu
dikoreksi kemungkinan
adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi
pada 260 nm.
Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan
kontaminasi
oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260
menentukan faktor koreksi
yang ada dalam suatu tabel.
Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x
pengenceran
Alat Spektrofotometer
DAFTAR PUSTAKA
1. Anonim. 2008. Protein.
(http://www.wikipedia.com) diakses tanggal 12
Oktober 2008.
2. Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian.
Penerbit Liberty: Yogyakarta.
3. Page, D.S. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Erlangga: Jakarta.
4. Santoso, H. 2008. Protein dan Enzim. (http://www.heruswn.teachnology.
com) diakses tanggal 12 Oktober 2008.
5. Sloane, E. 2004. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Penerbit Buku
Kedokteran EGC: Jakarta.
6. Anonim. 2007. Manfaat Protein dalam Kehidupan
Sehari-hari.
(http://www.blogger.com) diakses tanggal 12
Oktober 2008
7. Sudjadi, A. dan Rohman. 2004. Analisis Obat dan Makanan cetakan I.
Yogyakarta: Yayasan Farmasi Indonesia.
8. Apriyantono, A. dkk. 1989. Analisis Pangan. Bogor: Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi
Psat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB.
9. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit UI-Press.
10.Kamal, M. 1991. Nutrisi Ternak Dasar. Laboratorium Makanan Ternak,
Yogyakarta: UGM-Press
0 komentar:
Posting Komentar